Mark Ruffalo commence sa carrière au théâtre et fonde sa troupe l’Orpheus Theatre Company. Il obtient ses premiers rôles au cinéma au début des années 1990 dans Rough Trade et A Song for You. Après de nombreux petits rôles, il se fait remarquer en 2001 dans la comédie dramatique Tu peux compter sur moi.
Cela lui permet d'obtenir des rôles plus importants dans des grosses productions américaines telles que Le Dernier Château (The Last Castle) aux côtés de Robert Redford et Les Messagers du vent aux côtés de Nicolas Cage. En inspecteur de police dans Collatéral face à Tom Cruise, ou bien en ami à l'écoute dans 30 ans sinon rien, Mark Ruffalo jongle entre polar et comédie.
En 2007, David Fincher lui offre un rôle marquant dans le thriller Zodiac où il a pour partenaire Robert Downey Jr. et Jake Gyllenhaal. Sa performance lui permet de passer à des rôles plus exposés.
Si la comédie d'espionnage Une arnaque presque parfaite, écrite et réalisée par Rian Johnson, est un flop commercial et que le polar Boston Streets passe inaperçu (et sort directement en DVD en France), l'année 2009 marque la sortie de son premier long métrage en tant que réalisateur, Sympathy for Delicious, qui obtient le prix spécial du jury au festival du film de Sundance.
En 2010, sa notoriété augmente et il fait partie des révélations de l'année. Il tient en effet le premier rôle masculin de la comédie dramatique indépendante Tout va bien ! The Kids Are All Right de Lisa Cholodenko, aux côtés de Julianne Moore et Annette Bening, qui est acclamée par la critique et reçoit plusieurs nominations aux Oscars. L'acteur reçoit lui-même une nomination à l'Oscar du meilleur acteur dans un second rôle. Il est également à l'affiche du thriller psychologique Shutter Island, mis en scène par Martin Scorsese, où il donne la réplique à Leonardo DiCaprio. Enfin, il tient un second rôle dans la comédie Crazy Night, de Shawn Levy, menée par Tina Fey et Steve Carell.
La reconnaissance de cette polyvalence culmine avec le choix des studios Marvel de lui confier le rôle convoité du Dr Bruce Banner / Hulk, en remplacement d'Edward Norton. Il fait ses débuts sous les traits du géant vert dans le blockbuster Avengers, important succès critique et commercial de l'été 2012, écrit et réalisé par Joss Whedon.
La même année, il retrouve le coscénariste de Tout va bien ! The Kids Are All Right, qui le dirige dans la comédie dramatique chorale Sex Therapy, qui passe cependant inaperçue.
En revanche, en 2013, le blockbuster choral Insaisissables, mis en scène par le français Louis Leterrier, impressionne au box-office mondial, malgré des critiques mitigées. Tandis que la comédie musicale indépendante New York Melody, écrite et réalisée par John Carney, avec Keira Knightley, est un succès critique et commercial surprise.
En 2014, il incarne un ex-lutteur dans le thriller psychologique Foxcatcher aux côtés de Steve Carell et Channing Tatum. Ce retour à des productions noires et adultes, sous la direction de Bennett Miller, lui permet de décrocher une nomination à la 87e cérémonie des Oscars dans la catégorie meilleur acteur dans un second rôle.
En 2015, il reste dans un registre dramatique pour le film indépendant Daddy Cool, produit par J.J. Abrams, où il a pour partenaire Zoe Saldana, mais revient surtout sous les traits de Hulk dans Avengers : L'Ère d'Ultron, écrit et réalisé par Joss Whedon. Si le premier passe inaperçu, il lui permet de décrocher une nomination au Golden Globe du meilleur acteur dans un film musical ou une comédie en 2016. Tandis que le second est un nouveau succès commercial mondial.
Mais la fin de l'année est surtout marquée par la sortie du drame indépendant Spotlight, écrit et réalisé par Thomas McCarthy, où il incarne l'un des journalistes du Boston Globe lancés dans l'affaire d'un scandale ayant impliqué le diocèse de la ville éponyme et dévoilé au début des années 2000. Son interprétation de l'obstiné et passionné Michael Rezendes lui vaut une large reconnaissance critique, dont une troisième nomination à l'Oscar du meilleur acteur dans un second rôle.
En 2016, il est dans le film Insaisissables 2, réalisé par Jon M. Chu.
En 2017, il sortira de son statut de second rôle chez Marvel en partageant l'affiche de Thor: Ragnarok, avec Chris Hemsworth, sous la direction de Taika Waititi. Il sera également à l'affiche d'Avengers: Infinity War en 2018 et Avengers 4 en 2019.
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